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1965年，周作人在给鲍耀明的信中说：“知海外报刊时常提及鄙人，无论是称赞或骂，都很可感，因为这比默杀好得多。”
周作人的遗嘱如是说：“余今年已整八十岁。死无遗恨，姑留一言以为身后治事之指针。尔死后即付火葬或延例留骨灰，亦随便埋却，人死声销迹灭最是理想。余一生文字无足称道，惟暮年所译希腊对话是五十年来的心愿，识者当自知之。”
羽太信子患病期间，为了给妻子筹集药费，周作人将记载了68年的日记卖给鲁迅博物馆。
1966年8月22日，一群红卫兵冲进八道湾，砸了周母的牌位（鲁迅博物馆中，同一位母亲的巨幅遗照受到了万众敬仰）。24日早晨，红卫兵宣布对周作人实行“无产阶级专政”，将他住的日式榻榻米的卧室砸烂，全家被洗劫一空，房子被查封。红卫兵让周作人跪在地上接受批斗，用手中的皮带不断抽打他，让他老实交待罪行。周丰一也被揪来陪斗，红卫兵绑住他的双手，将他推倒在地，连踢带打。他的衣衫浸满血迹，人被打晕过去，被大雨浇醒过来，再斗再打，不让他有一刻喘息的机会。一个红卫兵还把周丰一的手表掠下来带在自己手上。风烛残年的周作人跪在一旁目睹儿子挨打，吓得晕倒在地。
接着，红卫兵命令周作人穿着黑色布衣，身上挂上写着他名字的白布条，任凭人们在窗外观看和辱骂。红卫兵又将周作人等专政对象集合起来游街示众。周作人脖子上挂着沉重的大牌子，面无人色，无力行走，只能跪在地上边呻吟边爬行。
这年8月23日夜，周作人写下最后一篇日记：“晴。二十二度。上午阅毛泽东论文艺，下午吉宜为寄耀辰信又件，内春信等三册。”
周作人被抄家后，鲁迅博物馆的工作人员叶淑穗等人去看望了他：“当我们走进他被关的小棚子里时，眼前呈现的一切确实是惨不忍睹。昔日衣帽整齐的周作人，今日却睡在搭在地上的木板上，脸色苍白，身穿一件黑布衣，衣服上钉着一个白色的布条，上面写着他的名字。此时，他似睡非睡，痛苦地呻吟着，看上去已无力站起来了，而且几个恶狠狠的红卫兵却拿着皮带用力地抽打他，叫他起来。看到这种情景，我们还能说什么呢？只好赶快离开……”
周家的房子被封，后罩房正对着的“老虎尾巴”被红卫兵占领，用于监视周氏一家，周作人只能蜷缩在后罩房的屋檐下，过了三天三夜。周家的老保姆悄悄做点食物，给他们送过去。天下起雨来，周作人的儿媳张菼芳硬着头皮去央求红卫兵道：“我们也不能老呆在露天底下呀，好歹给我们个安身的地方吧。”这样，周作人才被允许睡在自家的澡堂里。半个月后，张菼芳再次向红卫兵求情，这次总算在漏雨的小厨房的北角为老公公东拼西凑搭了个铺板床，让他卧在上面。
红卫兵为周家规定了生活标准：老保姆15元，周作人10元。他们告诉粮店，只允许周家买粗粮。周作人一日三餐只能就着臭豆腐喝点玉米面糊糊。由于营养不良，又整日被囚禁在小屋里，他的双腿很快就浮肿了。张菼芳只能到药铺买点维生素片，等红卫兵熟睡后，偷偷塞给周作人，周感激地堆儿媳说：“我还不如早点死掉算啦，免得这么连累你们。”
到九、十月间，周作人两次写“呈文”，让儿媳偷偷交给派出所。两份呈文内容都很短，大意为：共产党素来是最讲究革命人道主义的。鄙人已年过八旬，再延长寿命，也只是徒然给家人添负担而已。恳请公安机关，恩准鄙人服安眠药，采取“安乐死”一途。但“请准予赐死”的“呈文”交上去后，就如石沉大海。
1967年4月末，周作人屡屡表示不想活了，他对儿子说：“我不如死掉还舒坦一些，也不想连累你们大家了……尤其是菼芳。她是外姓人，嫁到周家，跟着咱们受这份罪，实在对不起她……”他又加上一句：“我是和尚转世的。”
【非命】
1967年5月6日早晨，张菼芳照例给公公倒完马桶，为他准备好一瓶开水，就上班去了。下午两点多，住在同院的邻居，偶然从窗子往周作人的屋里看了看，只见老人趴在铺板上一动不动，姿势很不自然。他感到不妙，赶紧打电话给张菼芳，让她回家。张赶回家后，发现周作人浑身早已冰凉。众人猜测，周作人大概是要下地解手时，猝然发病，连鞋都来不及穿就溘然长逝了。周丰一夫妇不可能将遗体送到医院去查明死因，只是匆匆销了户口，火化了事，连骨灰匣都没敢拿回来。
钱理群的《周作人传》中记载：“周作人逝世后，曾给周海婴寄去讣闻，海婴考虑再三，没有参加追悼会：鲁迅与周作人的后代之间终于没有任何来往。”
生前，周作人为许多人写过挽联，死后，却无一人作联来挽他。次年，在台湾的梁实秋写下《忆启明老人》一文，这是周作人去世时对他唯一的纪念文字。
【评说】
舒芜说：“周作人的身上，就有中国新文学史和新文化运动史的一半，不了解周作人，就不可能了解一部完整的中国新文学史和新文化运动史。”
周建人说哥哥周作人：“周作人自小性情和顺，不固执己见，很好相处，但他似乎既不能明辨是非，又无力摆脱控制和掌握。从八道湾制造的兄弟失和事情中，表演得很充分。这似乎纯系家庭内部矛盾问题，却包古着大是大非的原则问题，他从这一点上合鲁迅分了手，以后的道路也就越走越远了。”
徐志摩说周作人：“他是个博学的人；他随手引证，左右逢源；但见解意境都是他自己的，和他的文章一样。”
冯雪峰对周建人说，他看过周作人的《谈龙集》等文章，认为周作人是中国第一流的文学家，鲁迅去世后，他的学识文章，没有人能相比。
有人说，周作人向来不是一个积极的人，性情温和，头脑冷静，眼光敏捷。他在新文化运动之初，最早提出“人的文学”的口号，为新诗铺路，探索现代白话文的源头，翻译国外小说及思想著作，关注妇女儿童问题，扩宽了几种文章的领域，不愧为新文化运动的一代大师。
陶亢德说，如果以酒来比喻鲁迅、周作人兄弟，鲁迅“是不加其他饮料的原本威士忌，而知堂翁则是加了点荷兰水的威士忌而已”。
钱玄同在《新青年》发表《关于新文学的三件要事》一文中说：“周启明君翻译外国小说，照原文直译，不敢稍以己变更。他既不愿用那‘达诣’的办法，借外国人学中国人说话的调子；尤不屑像那‘清室举人’的办法，叫外国文人都变成蒲松龄的不通徒弟，我以为他在中国近年的翻译界中，是开新纪元的。”
胡适在《五十年来中国之文学》一文中说，中国的文学革命，在建设方面，有两件事可记，一是“白话诗的试验”，二是“欧洲新文学的提倡”，后者以“周作人的成绩最好。他用的是直译的方法，严格的尽量保全原文的文法与口气。这种译法，近年来很有人仿效，是国语的欧化的一个起点”。
废名说，他和俞平伯谈到周作人时，二人认为，知堂先生是一个唯物论者，一个躬行君子。他们从知堂先生可以学得一些道理，日常生活之间他们却学不到他的那个艺术的态度。俞平伯以一个思索的神气说道：“中国历史上曾有像他这样气分的人没有？”两人都回答不了。废名认为，大概只有“渐近自然”四个字能形容周作人。
曹聚仁说：“我对于启明先生的敬意，不自今自始；他的每一种散文集必比以前一种更醇厚深切，更和我个人的口味，愈益增加我的敬慕之情。……周先生所修都是不朽的胜业，只能‘藏之名山，传之其人’……”
张中行评价周作人：小事不糊涂，大事糊涂。
张中行说老师周作人：“在我的师辈里，读书多，知识丰富，周氏应该排在第一位。这最明显地表现在他的文章里，上天下地，三教九流，由宇宙之大到苍蝇之微，他几乎无所不谈。”
舒芜说：如果不仅从周作人的后期历史来看，而是从他的整个历史来看，应该说这是中国文化传统的悲剧，是知识分子命运的悲剧。中国知识分子肩负着中国文化传统，在国家命运突然面临着几千年未有的大变局之时，每个人都有一个命运的问题：或是不能克服文化传统中的消极核心而失败，一切文章学问，功绩成就同归于尽，这就是周作人的悲剧；或是毕生同这个消极核心战斗，鲁迅就是这样谱出了胜利的乐章。
何其芳比较周氏兄弟的文章：“读着两人早期的文章，我们就总有着不同的感觉。一个使你兴奋起来，一个使你沉静下去。一个使你像晒着太阳，一个使你像闲坐在树荫下。一个沉郁地解剖着黑暗，却能够给予你以希望和勇气，想做事情，一个安静地谈说着人生或其他，却反而使你想离开人生，去闭起眼睛来做梦。”
朱光潜说：“周先生自己说是绍兴人，没有摆脱‘师爷气’。他和鲁迅是弟兄，所以作风很相近。但是作人先生是师爷派的诗人，鲁迅先生是师爷派的小说家，所以师爷气在《雨天的书》里只是冷，在《华盖集》里便不免冷而酷了。”
林语堂说周氏兄弟：“周氏兄弟，趋两极端。鲁迅极热，作人极冷。两人都是天才，而冷不如热。……每逢语丝茶话，两位都常来……作人不大说话，而泰然自若，说话声调是低微的，与其文一样，永不高喊。鲁迅则诙谐百出。”
陈源写信给徐志摩谈及鲁迅、周作人兄弟，他说，周作人与鲁迅比较起来，“真是小巫遇见了大巫。有人说，他们兄弟俩都有他们贵乡绍兴的刑名师爷的脾气。这话